Multitron CHO 細胞培養

2025-01-13 15:21:00    infors5344 分享

導語：搖瓶的使用對動物細胞的培養越來越重要。以下各搖瓶中培養CHO（中國倉鼠卵巢）細胞的示例表明，Multitron細胞培養搖床（INFORS HT，CH Bottmingen）適合種子液的生產。

1. 簡述
搖瓶的使用對動物細胞的培養越來越重要。以下各搖瓶中培養CHO（中國倉鼠卵巢）細胞的示例表明，Multitron細胞培養搖床（INFORS HT，CH Bottmingen）適合種子液的生產。

CHO細胞系是生物技藝中常用的細胞系。為了生產用於接種的種子培養液和生產SEAP蛋白，使用了CHO-XM-111細胞株。瑞士蘇黎世聯邦理工學院 M.Fussengerger 教授的團隊用編碼重組蛋白SEAP（分泌型堿性磷酸酶）基因的表達載體轉染該細胞株，並使用由四環素控製的啟動子PhCMV-1。表達載體的使用使得通過啟動子可選擇性表達兩個基因成為可能。這樣就可以生產SEAP蛋白，包括非生產性的生長階段，和基於無四環素培養基交換的增殖抑.製生產階段。

2. Multitron 技藝參數
*  50 mm 振幅 (可選25mm)
*  通氣 空氣和  CO2 (0 – 20% asstandard)
*  蒸汽濕度套件（可選）
*  不同可選托盤 (一次培養袋托盤, 粘性托盤，通用托盤等)
*  其他選項 (製冷, 去汙, ShakerBag等)

3. 實驗條件
為了在生物反應器中生產種子培養液（作為後期培養的接種物）和SEAP，使用CHO-XM-111細胞系，無血清和無蛋白的HP-1培養基（Cell Culture Technologies GmbH）在250 mL、500 mL和1000mL搖瓶中進行培養。在培養基中添加2g/L Pluronic F-68（Sigma）和2.5 mg/L 四環素（Sigma）。設置溫度37℃，濕度85% 和5%的CO2飽和度。搖瓶以恒定的122 rpm轉速在Multitron（INFORS-HT, CH-Bottmingen）中培養。

4. 批次補料振蕩培養
采用不同體積的搖瓶和相應的補料策略。

a) 在250ml搖瓶中的培養過程按照以下模式進行：

天/小時 – 步驟	體積（mL）	每毫升細胞濃度	存活百分比
0 d/0 h – 接種	50	3.0 x 105	86.9
1 d/21 h – 補料	50 (+ 30 mL)	6.6 x 105	91
2 d/43 h	80 (max. 32%)	1.95 x 106	97.4
3 d/67 h	80	2.25 x 106	98.3
4 d/91 h	80	1.95 x 106	98.7

Z大比生長速率μmax為0.048 h^-1，倍增時間td =14.4h。

圖1: Multitron

b) 在500ml搖瓶中的培養過程按照以下模式進行：

天/小時 – 步驟	體積（mL）	每毫升細胞濃度	存活百分比
0 d/0 h – 接種	100	7.8 x 105	95.5
1 d/24 h – 補料	100 (+ 50 mL)	1.88 x 106	98.7
2 d/47 h – 補料	150 (+ 50 mL)	2.18 x 106	99.1
3 d/67 h – 更換培養基	250 (+ 50 mL)	2.33 x 106	99.3
4 d/91 h	300 (max. 60%)	2.63 x 106	99.7
5 d/115 h	300	4.65 x 106	99.4
6 d/139 h	300	3.90 x 106	98.1
7 d/163 h	300	2.55 x 106	81.8

Z大比生長速率μmax為0.024 h^-1，倍增時間td =28.9h。

c) 在1000ml搖瓶中的培養過程按照以下模式進行：

天/小時 – 步驟	體積（mL）	每毫升細胞濃度	存活百分比
0 d/0 h – 接種	150	6.6 x 105	98.9
1 d/23 h – 補料	150 (+ 50 mL)	9.6 x 105	98.9
2 d/45 h – 補料	200 (+ 50 mL)	1.95 x 106	99
3 d/66 h – 補料	250 (+ 50 mL)	1.10 x 106	99.3
4 d/93 h	300	2.18 x 106	99.4
5 d/117 h –   15-fold dilution	400 (max. 40%)	2.25 x 106	98.5
8 d/189 h	400	1.40 x 106	66.9

Z大比生長速率μmax為0.044 h^-1，倍增時間td =15.65h。

d) 蒸汽加濕
為了檢測每日液體損失，使用125 mL搖瓶，工作體積為15 mL、20 mL和25 mL，在溫度為37°C，濕度為85% rH的培養前後測定總體積。

5. 分析
a)  參數分析
每天使用細胞計數器yc100（Chemotec）測定活細胞濃度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus（Nova Biomedical）完成生長和生產基質的分析

b)公式                                                                                                                   
對於Z大生長速率μmax和倍增時間td的計算，使用以下公式。

6. 結果分析
為了優化CHO種子液培養，在Multitron細胞培養搖床中設置了三個不同體積的搖瓶（250ml、500ml和1000ml）。在培養CHO-XM-111細胞的同時，每天取樣檢測，從而可以**地比較細胞濃度、底物消耗和緩沖液。

對比Z大細胞濃度表明，500ml 搖瓶中的培養物每毫升可產生4.65×106個細胞。在培養物中，6天內可達到98%以上的存活率。通過優化補料策略，種子培養可在2天後進行，Zui多5天（圖2）。

圖2：對比細胞濃度和活力

葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量，尤其在500mL搖瓶中，表明底物在第五天之前是足夠的，因此補料可防止底物限製（圖3）.

圖3：對比葡萄糖和谷氨酰胺

已知同時形成銨，乳酸和谷氨酸可降低細胞生長速率。在培養物中，在培養的第五天也觀察到亞臨界濃度的銨。此外，通氣和連續供應5％的CO₂可以為培養系統供應**緩沖，因此也可以供應合適的pH條件（圖4）。

圖4:比較銨的含量，谷氨酸鹽，乳酸和pH

直接蒸汽加濕對培養基損失有重要影響，同時也會改變滲透壓。
特別是在小工作體積下，一天的Z大蒸發量小於0.4%。

圖5:125mL揮發量

搖瓶的工作體積對氧交換有很大影響，不應超過搖瓶Zui適工作體積。

7. 總結

培養2-5天後，細胞總數達到1.8 x 10⁸和1.4 x 10⁹之間。它可用作2.5L生物反應器的接種物，活細胞濃度約為每毫升5×10⁵。
接種細胞密度和細胞活力越高，培養過程中細胞密度越高。
**盡早更換培養基
在較小接種量和**補料策略允許的情況下，可額外補充細胞培養營養物質。另一方面，培養液被稀釋，因此有毒產物減少。
在85%相對濕度條件下，蒸發量小於0.5%，可達成穩定的滲透壓和工藝再現性。

搖瓶培養可用於進一步的工藝步驟，例如接種生物反應器或一次性袋。

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