培養細胞中的線粒體提取

2018-01-18 20:06:00    infors11344 分享

導語：分離線粒體的原理：從組織或細胞中分離線粒體的關鍵步驟，大致相同

——使用杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

本文僅用於研究用途

一、展現

    分離線粒體的原理：從組織或細胞中分離線粒體的關鍵步驟，大致相同：（1）通過機械和/或化學手段使細胞破裂，（2）低速離心以除去雜質和較大的細胞器，隨後以較高的速度離心，以分離收集的線粒體。 此種線粒體分離方法可以滿足大多數應用。 下述步驟詳述提取步驟，旨在供應能夠獲得盡可能高產量和酶活性的線粒體。

二、實驗方案（詳見6操作步驟）

1、凍融法弱化細胞膜，以5.0mg / ml懸浮於試劑A中，置於冰上10分鐘。

2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 勻漿，損壞細胞膜

3、SPIN 1: 4°C溫度下1000g離心力，離心10分鐘，收集上清液#1. 重復收集上清液#2

4、SPIN 2: 4°C溫度下12,000g離心力，離心15分鐘，棄上清，保留沈澱。

5、加入C試劑，蛋白酶抑製劑，使用渦旋振蕩器重懸沈澱，分裝-80°C保存

6、線粒體測定：蛋白質濃度，OXPHOS活性，Western Blot

三、關鍵試劑和儀器

1、試劑A 50ml

2、試劑B 50ml

3、試劑C 10ml

4、杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)

5、渦旋混合器VORTEX3000

6、低溫高速離心機BIOCEN 22R
 

四、存儲條件

試劑A/B/C， 4°C存儲
 

五、其他試劑和儀器

 

1、雙蒸水

2、蛋白酶抑製劑（PI）

3、BCA蛋白質分析

4、2ml離心管

5、天平等實驗室常規設備

 

六、操作步驟

線粒體製備遵循三個簡單的步驟：細胞破裂，離心去除雜質和大的細胞器，離心分離線粒體。 以下是從培養的人類細胞中製備線粒體的指導原則。 試劑和樣品應盡可能冷藏。 建議使用4 x 150 mm的融合細胞平板（約4x107個細胞）。

1、收集細胞：在貼壁細胞的情況下，它們可以用細胞提取器收集，並通過在1000g離心沈澱。 每個平板通常產生2mg全細胞蛋白質。 這可通過蛋白質測定來檢查。

2、使用凍融發弱化細胞膜

3、按照5mg蛋白加入1ml試劑A量進行計算，在2ml離心管中重懸細胞

4、冰上放置10min

損壞細胞膜：

5、將細胞轉入預冷的杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。.

6、使用LOOSE杵，勻漿30次

7、轉移勻漿液到2ml離心管中.

 

SPIN 1:

8、 4°C溫度下1000g離心力，離心10分鐘

9、收集上清液#1.

10、加入試劑 B 重懸沈澱，加入體積與第3步等同.

11、重復損壞細胞膜和 SPIN1中的 第8步.

12、收集上清液，記作(SN) #2，丟棄沈澱

13、充分混合 #1 & #2, 加到2ml離心管中，如果超過2ml 請均分到兩個離心管中

 

SPIN 2:

14、4°C溫度下12,000g離心力，離心15分鐘

15、棄上清，保留沈澱

16、使用500μl試劑C，重懸沈澱，同時加入蛋白酶抑製劑

17、分裝-80°C保存備用.

 

七、常見問題分析

問題	可能引起原因	解決方法
線粒體離心沈澱很少	沒有充分將細胞破碎	增加勻漿次數
大量的細胞色素C	細胞過度溶解/細胞不新鮮	減少勻漿次數/選取新鮮細胞
線粒體純度低	存在汙染	降低SPIN2離心力到6000g

杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

VORTEX3000

低溫高速離心機BIOCEN 22R

 

附錄一（參考 ab110171 ）：

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